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健康食品之胃腸功能改善評估方法 2003/08/29

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    食品輸入及查驗登記

健康食品之胃腸功能改善評估方法

880802衛署食字第88037803號公告

920829衛署食字第0920401629號公告修正

壹、前言

    消化器官的主要功能是使食物消化,營養素吸收及排便。消化最主要是經由消化酵素的作用,自律神經的調節及體液性的調節(消化管荷爾蒙等)等系統來控制。因此,除了病原菌的侵襲外,各種飲食內容的改變及精神壓力或過敏都會引起胃腸道的不適,影響食物的消化及營養素的吸收。

    人類的腸道中棲息了約數百種細菌,這些正常菌相的存在,除了可抑制有害病菌在腸內孳生及危害外,且可產生人體所需的物質,如維生素B 及K等。在人體正常菌相中,包含了有益菌與有害菌,有益菌產生的代謝產物(如乳酸與醋酸)可抑制有害菌的增殖,對健康的維持與整腸方面有相當的幫助。一般健康人體腸道中有害細菌(如產氣莢膜梭菌Clostridium perfringens)含量不高,無法危害人體,然而身體的不適,飲食及環境的變化、精神壓力、老化等都可能使有害菌增加,造成腸內菌相平衡的崩解,進而引起便祕、下痢。 

    食品種類繁多,其中部份食品可改善食慾,促進消化酵素的分泌,增進胃腸蠕動,增加小腸吸收。食品亦可因含有利腸道益生菌生長的成份,或本身含有腸道中的有益細菌,因而具改善腸內菌相的功能。因此,若食品具有(1) 促進消化吸收,(2) 改善腸內細菌菌相,(3)促進胃腸蠕動,幫助維持腸道正常機能等三種功能中任一種功能時,可認為具有改善胃腸道功能。

貳、實驗方法及結果判定

 一、評估對胃腸道功能改善之要點與原則:

      (一)改善胃腸功能必須明確具有以下四種功能指標之ㄧ。

         1.促進消化吸收

         2.改善腸內細菌菌相

        3.幫助(改善)胃腸運動

        4.有助於胃黏膜之保護作用

     (二)所進行的實驗可分為動物實驗與人體實驗,兩者可擇一施行。

     (三)若廠商所提產品的相關科學研究證據不明確或不足時,須同時進行「人體實驗」和

          「動物實驗」,以加強證據之可信度。

    (四)動物實驗進行時間至少需4星期以上,人體實驗至少需進行2星期以上。

    (五)所使用的實驗動物以哺乳類動物為原則。動物隻數每組至少為8隻,小白鼠隻數每

           組至少為10隻。

    (六)實驗動物必須來自各大實驗動物中心。

    (七)人體實驗每組人數至少為8人,且必須有控制組。

    (八)人體實驗必須由大學食品、營養、醫藥等相關系所、研究機構、醫學中心執行,

           需有醫師參與,並遵循衛生單位對人體實驗有關之相關規定。

    (九)動物實驗進行時,飼料的內容與比例必須符合AIN(American Institute of

           Nutrition)之規範,進行人體實驗的飲食內容與比例必須符合衛生署所公佈之飲食指南。

    (十)評估對胃腸道功能所採用的實驗方法,必須是學術界或醫學單位所採用或普遍認

           可之方法,亦可使用市售的生化試劑(Test Kit)直接測定之。

二、促進消化吸收

 (一)動物實驗

    1.動物體重的測定及消化吸收率的測定

    2.消化酵素活性的測定:如trypsin, chymotrypsin, amylase, lipase, leucine amino peptidase, disaccharidase。

 (二)人體實驗

    1 .有關改善食慾不佳方面,觀察食慾、食量、體重、血紅素等指標的變化。

    2.有關改善消化吸收不良方面,觀察食慾、食量、胃腸腹脹感、糞便形狀及次數、胃腸運動及小腸吸收等指標變化。

 (三)結果判定

   1.動物實驗中必須至少一項指標為實驗組明顯優於控制組(p<0.05)。

   2.人體實驗方面,如果是針對改善兒童食慾方面,以食慾、食量的改善為觀察重點。體重及血紅素的變化則作為輔助指標。

   3.針對消化吸收不良者,除了有明顯改善食慾、食量,胃腸腹脹感及糞便形狀等消化不良症狀外,在小腸吸收指標中至少有一項指標為實驗組明顯優於控制組(p<0.05)。

   4.如果符合以上要求即可判定測試食品具有促進消化吸收作用。

(四)測定方法

  1.消化酵素活性測定

   樣品製備:

     截取實驗老鼠(Sprague-Dawley或Wistar品系) 小腸片段,刮下腸黏膜(脂解酵素活性測定不必刮下腸黏膜),取0.2 g加入2 mL含protease抑制劑(1 mM phenylmethylsulfonylfluoride及2.2 mM iodoacetic acid) 之4oC、0.9% NaCl溶液,以均質機均質化。

     (1)雙醣酵素 (disaccharidase) 活性測定

   目的:測定小腸雙醣類消化酵素(乳糖酵素、麥芽糖酵素與蔗糖酵素)活性。

   測定方法:取30 mL的腸黏膜均質液加入15 mL的56 mM雙醣溶液(乳糖、麥芽糖或蔗糖)於37oC下作用30分鐘,再加入100 mL的 0.6 N NaOH溶液溶解細胞,另以10 mL 的6 N HCl溶液中和之。取45 mL處理過後之腸黏膜液或葡萄糖標準液(0-40 mg/mL)與625 mL反應緩衝液(50 mM Tris-malate、33 mM sodium potassium phosphate與30 mM MgCl2,pH 6.8)、150 mL的1 mM ATP、150 mL的1 mM NADP、15 mL的330 IU/mL hexokinase (EC 2.7.1.11)與15 mL的170 IU/mL glucose-6-phosphate dehydrogenase (EC 1.1.1.49) 於37oC下作用30分鐘,最後將樣品置於冰浴上以終止其反應。葡萄糖產物含量則以分光光度計於340 nm波長下測定減少的NADPH,並以改良的Lowry方法測定樣品中蛋白質含量,而雙醣酵素活性以 mM 葡萄糖/分鐘/mg 蛋白質表示之。

    (2)脂解酵素 (lipase) 活性測定

  目的:測定小腸內脂質消化酵素活性

  測定方法﹕用市售試劑組(Sigma Lipase-PSä)測定之。將900 mL受質溶液(1.1 mM 1,2-diglyceride、2 mM sodium N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-m-toluidine、0.66 mM ATP、860 U/L monoglyceride lipase、1340 U/L glycerol kinase、40,000 U/L glycerol-3-phosphate oxidase、1340 U/L horseradish peroxidase、40,000 U/L co-lipase 與緩衝液)加至15 mL之腸均質液或標準液(附於試劑組)中,於37oC下作用3-5分鐘,再加入300 mL活化劑(36 mM deoxycholate、6 mM 4-aminoantipyrine、0.05% sodium azide與緩衝液),於37oC下作用3分鐘後,以分光光度計於550 nm波長下測定2分鐘,並以改良的Lowry方法測定樣品中蛋白質含量,而脂解酵素活性以unit/mg 蛋白質表示之。  

    (3)白胺酸胺基酵素 (leucine aminopeptidase,LAP) 活性測定

  目的:測定小腸絨毛刷狀緣膜上蛋白質消化酵素活性。

  測定方法﹕用市售試劑組(Sigma Diagnosticsâ LAP)測定之。取0.5 mL腸黏膜均質液,混合0.5 mL LAP受質溶液(20 mg/dL L-leucyl-b-naphthylamine溶於phosphate緩衝液,pH 7.1),於37oC下作用1小時,再加入0.5 mL的2 N HCl,1.5 mL處理過後之腸黏膜液或1.5 mL標準液(0-12 Sigma unit/mL)與0.5 mL sodium nitrite溶液,於室溫下作用3分鐘後,混合1.0 mL 0.5% (w/v) ammonium sulfamate,於室溫下作用3分鐘,再加入2.0 mL N-1-naphthylethylenediamine酒精溶液,於室溫下作用45分鐘後,以分光光度計於580 nm波長下測定吸光值,並以改良的Lowry方法測定樣品中蛋白質含量,而白胺酸胺基之酵素活性以Sigma unit/mg 蛋白質表示之。1 Sigma unit定義為於37oC、pH 7.1下,每1小時生成1 mmole b-naphthylamine的酵素量。

   判定:以上各一項有改善,表示有改善胃腸消化之功能。

 2.改善胃腸功能之參考指標:

   (1)Lundh測試(主要為胰臟功能):

 使用300 ml之流質食物(含6%脂肪﹑5%蛋白質及15%醣類),並放置十二指腸管,依時段抽取十二指腸液,以測定消化酵素之濃度(如Trypsin)或以內視鏡抽取胰液作消化酵素之分析。

 (2)Schilling測試(主要為胃腸功能)

    -以維生素B12之吸收來測定胃腸功能

    -以放射性標示之維他命B12給予空腹之受試者

    -一小時後再由肌肉注射未標示B12

    -24小時後收集尿液,並測定B12含量

    -7天後重複此步驟,但口服B12則加入Intrinsic factor

    -兩次檢查加以比較評估

    (3)脂肪之吸收判定:

    糞便脂肪分析:

    -正常值:< 7g/day

    -每日食用食物中至少有100 g中鏈三酸甘油酯共三天;並收集糞便3天

    -測定糞便中脂肪含量

    -使用Sudan stain,只可測三酸甘油酯及lipalytic product

    (4)D-xylose耐受測試(主要為小腸功能):

    -主要測定近端小腸之醣類吸收

    -隔夜禁食,再服用25g之D-xylose,5小時後之尿液中若xylose排出大於25%,即表示正常。

    -1及2小時抽血,若其中一次大人血中xylose>300 mg/L,或小孩血中xylose >100 mg/L,則表示正常。



    (5)核子醫學檢查

    目前只使用於gastric emptying study

 

    -受試者服下含有放射源(Tc-99m and In-111)的固體及液體食物

    -測量受試者90分後的胃排空率



     (6)放射線科檢查

     小腸排空速度檢測

    -受試者喝下600 cc barium後,隔15分透視一次,直到barium完全排出ileocecal valve

三、改善腸內細菌 

 

(一)動物實驗:

  1.檢測1種益生菌:Bifidobacterium

    2.檢測1種有害(或無益)菌:Clostridium perfringens

(二)人體實驗:

  1.檢測1種益生菌:Bifidobacterium

    2.檢測1種有害(或無益)菌:Clostridium perfringens

(三)測定方法:

  1.腸內細菌菌相

      (1)材料

       A.

       a.大白鼠:雄性 Spraguae Dawley(SD)或Wistar系統大白鼠之盲腸或糞便。

       b.人體糞便。

       B.培養基

          a. 雙叉桿菌(Bifidobacteria)參考培養基:

           (a)  Bifidobacteria iodoacetate medium –25(BIM-25)

           (b)  MPN medium

           (c)  Beerens medium  

           b. 產氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)參考培養基

               Tryptose-sulfite-D-cycloserine(TSC)agar  

  有關製備請參考各相關參考文獻。

   (2)方法

     A.取樣及均質

       (a)動物實驗::以按摩方式收集糞便於密閉容器內(維持厭氧狀態),再於厭氧操作箱內秤取約0.5 g,加入含4.5 mL無菌厭氧稀釋液(附註)之試管中(內含5粒玻璃珠),以試管震盪器混合。

           (a)-1大白鼠經餵養試驗後,麻醉,解剖,在厭氧狀況取出盲腸(cecum)內容物,秤取約1 g,加入含9 mL無菌厭氧稀釋液之試管中(內含5粒玻璃珠),以試管震盪器混合。

       (b)人體試驗:收集糞便於密閉容器內(維持厭氧狀態),再於厭氧操作箱內,進行如同上述大白鼠樣品之秤重及均質操作。 

 

  B.稀釋及微生物平板分析

於厭氧狀況下,上述均質液以厭氧稀釋液進行一系列十倍稀釋。取適當稀釋倍數,以表面塗抹法(spread plate method)或混稀平板法(pour plate method)加入雙叉桿菌培養基中,置於厭氧操作箱或厭氧缸中(內含厭氧包,或抽氣維持厭氧狀態),於35~37oC 培養,計數菌落數。

   至於產氣莢膜梭菌之計數,請依照美國FDA發行的Bacteriological Analytical Manual (BAM)。

 

  C.統計分析

實驗數據經統計變異數分析(Analysis of variance ANOVA)測試各實驗組間是否有差異,若有差異再以鄧肯氏多變試驗(Duncans multiple range test)作進一步分析,以決定各實驗組在95%可信度內是否有差異。

   

  D.結果判定

    動物實驗::若盲腸或糞便的bifidobacteria明顯增加,以及Clostridium perfringens減少或無明顯變化者,則稱之具改善腸內細菌相功能。

    人體試驗:若bifidobacteria明顯增加,以及Clostridium perfringens減少或無明顯變化者,則稱之具改善腸內細菌相功能。

 

附註 厭氧稀釋液之製備如下

Gelatin              0.2 g

Distilledwater       50 mL

Salts solution(如2.1.3中salts solution配方)   50 mL

Resazurin solution(25 mg/100 mL H2O)  0.4 mL

    將各成分混合,煮沸,冷卻,再加入0.05 g cysteine,`以厭氧操作分裝入試管中,每一試管裝9 mL,以121 oC殺菌15 min,殺菌完成或實驗過程呈粉紅色,請勿使用。

四、幫助(改善)胃腸運動,促進腸道正常機能之維持

(一)動物實驗:

1.  胃腸運動(活性碳、腸鋇計檢查或核子醫學檢查)

2.  胃黏膜保護

3.  觀察糞便之乾重、粒數、水分及形狀

(二)人體實驗:

1.腸運動(腸鋇計檢查或核子醫學檢查)

2.觀察排便時間,糞便重量、水分及形狀及排便感覺之變化。

(三)檢查方法

胃腸運動測定:

(a)   動物實驗

1.  離體實驗:擷取絕食老鼠之胃或腸片段約1-2cm,放於組織浴(organ bath)中並通氣之(95%O2,5%CO2),放置2hr使其穩定而後做等長收縮(0.5-1 gm),視測試食品對於胃或腸片段之收縮情況,若實驗組明顯優於控制組(p<0.05),即可判定,即可判定測試食品具有改善胃腸運動之功能。

2.  活體實驗:動物配置的灌胃溶液灌食(含有10%活性碳及測試物)。而後追蹤計算排空率,活性碳則以黑色易觀察之特性作為胃腸排空之另一指標。30分鐘後,大白鼠去頭犧牲,隨後剪開腹腔以線綁住賁門處,將胃、小腸完整取出,計算胃腸排空率,方法如下:

                     charcoal marker

Charcoal Transit =----------------------------   ×  100%

                     Intestinal length

   (b)   人體實驗

       1.核子醫學檢查:目前只使用於gastric emptying study

     —讓病人服下含有放射源(Tc-99m and In-i11)的固體及液體食物

     —測量病人90分後的胃排空率

      2.放射線科檢查:小腸排空速度檢測

    —請病人喝下600 cc鋇鹽(barium salt)後,隔15分透視一次,

    直到鋇鹽完全排出迴腸辮(ileocecal valve)。

(四) 結果判定:糞便重量或粒數明顯增加,再加上胃腸運動實驗或排便時間中有任何一項結果為實驗組明顯優於控制組(p<0.05),即可判定測試食品具有潤腸通便之功能。

五、有助於胃黏膜之保護作用,維持腸道正常機能

(一)實驗內容:      

     1.離體實驗:培養鼠胃黏膜細胞,先將測試物至於胃黏膜細胞內,培養2小時,而後置入酸性培養液(pH=4)或含indomethacin之培養液下。測定胃黏膜細胞之存活率(viability)的變化(MTT assay),若實驗組明顯優於控制組(p<0.05),即可判定測試食品具有保護作用之功能。

     2.活體實驗:胃酸的分泌測定:Shay 潰瘍法 (Shay’s ulcer)

雄性實驗絕食老鼠(24小時),胃部幽門結紮,再予以縫合復原,俟4小時候,將其犧牲取出胃部,收集胃液並定量胃液體積,並以0.1N NaOH溶液滴定,求其實驗組及控制組之總酸度之變化若p<0.05,即可判定測試食品具有胃黏膜保護作用之功能。

(二) 結果判定:任何一項結果為實驗組明顯優於控制組(p<0.05),即可判定測試食品具有幫助胃黏膜保護之功能。

六、減少胃內幽門螺旋桿菌

(一)受試者的篩選

    1.志願參與者先填寫一份問卷,包括個人飲食、生理習慣及健康狀況(含是否有慢性病,

需要隨時服藥等)。

    2.體檢,包括醫生問診、體位測驗、及血液生化檢查(含血紅素、血球比容、血糖、血脂肪、肝功能及腎功能)。

    3.依據前兩項的資料,篩去習慣特異及健康不良的參與者。然後填寫志願書,進行尿素呼氣試驗(urea breath test),以得13CO2 /12CO2比值(即ΔUBT值)。就ΔUBT值決定受試對象(建議ΔUBT>10%O者)。

(二)實驗方法

   1.受試者在實驗開始前三週每四天測一次ΔUBT值,以觀察其日常飲 食是否影響該值;並計算其平均值,以作為實驗開始後的比較。

   2.每位受試者於實驗前必須接受飲食指導。實驗開始前須經2~3週之穩定期,於穩定期間應按其個人之原飲食習慣攝食,並避免暴飲暴食或其他特殊食物之攝取,且亦不可服用整腸健胃藥物、補充劑、抗生素、組織胺-2拮抗劑、抗氧化劑、強調整腸健胃的機能性食品,或其他不明藥物等。並於該其間進行幽門螺旋桿菌之測試,而獲得至少最後之3次為近似恆定值,其平均值作為實驗之起始值(initial value)。

   3.實驗期間(最少二週)的飲食按上述穩定期間之條件進食,且加食試

驗品穩定與實驗期間定期測量其ΔUBT值、血液生化檢查、體檢、與問卷調查,以瞭解其實驗期間健康情形及身體的感覺。

   4.ΔUBT值測定:受試者在受試前一天晚上10點以後禁食,次晨刷牙、漱口,靜坐5分鐘後飲用200 mL的0.1 N檸檬酸溶液,漱口、靜坐10分鐘後,吹氣至2支10 mL的氣體收集管。再靜坐5分鐘後飲用50 mL含13C標識的尿素(50 mg)溶液,再漱口、靜坐10~20分鐘後,吹氣至2支10 mL的氣體收集管。所收集的氣體以isotope ratio mass spectrometer(IRMS)分析其ΔUBT值。

(三)結果判定

   1.若受試者之ΔUBT值於實驗後比實驗前有明顯(p<0.05)降低,則表示該試驗品具有減少幽門螺旋桿菌之生理功能。

   2.經體檢及問卷調查結果,若於實驗期間及實驗後一週沒有明顯不舒服的感覺或其他健康問題,特別是腸胃道問題,則可判斷該試驗品沒有安全上的問題。

 

 

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